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干细胞的原代提取、培养和传代扩增、纯化、冻存与复苏
2018-04-03 10:17:03
干细胞原代提取对环境和操作的要求非常高,新手进入干细胞领域进行原代提取的实验,因为无人指导,只能参考文献报道或者网上查询的操作步骤进行,往往因为未能注意实验细节而造成费时费力或者低效,从而对科研进度带来影响。麒盟生物经过多年干细胞研究项目的技术积累,在成体间充质干细胞以及胚胎干细胞的原代分离上具有丰富的经验,能够帮助客户快速的获取所需的原代干细胞,帮客户节约大量时间和精力。
 
1、间充质干细胞的原代提取
干细胞的原代提取根据细胞类型和组织材料的不同,而需要采用不用的分离方法。例如,神经干细胞通常采用无血清培养基自然筛选、流式细胞术分选或者免疫磁珠分选等方法。骨髓间充质干细胞通常采用密度梯度离心法和全骨髓贴壁法进行,而脂肪间充质干细胞则需要利用胶原酶进行消化获得细胞悬液再进行培养。
 

图1. 小鼠骨髓间充质干细胞的分离和体外培养示意图
 
2、干细胞的培养和传代扩增
干细胞的培养条件是维持干细胞自我更新和分化潜能最重要的因素,不同的培养基和血清都会有干细胞的生长产生影响。如今,大部分干细胞能够进行体外的传代扩增,然而某些干细胞,比如造血干细胞的体外扩增仍然是个科学难题,需要探索和优化培养条件。
 
3、干细胞的纯化
原代分离的细胞往往是多重类型细胞的混杂,不是一个均一的群体,比如人脐带血中原代分离的细胞就混有单个核细胞等。获得高纯度、一致性的干细胞是干细胞研究的必须步骤。纯化方法除了可以根据各种类型干细胞的生物学特性和表面标志等进行免疫法分选外,还可以利用不同的干细胞在特殊的培养基中生长或者贴壁的不同特性进行筛选,从而得到较为纯化的干细胞。
 
4、干细胞的冻存与复苏
干细胞的低温冻存不仅是考虑为了避免长期培养而可能造成污染以及运输转移等原因,同时也是因为原代细胞体外传代培养的有限性,为了最小化连续细胞传代的遗传改变和避免细胞的老化和转化,而必须进行不同代数尤其是低代数条件下的细胞冻存。细胞冻存液的选择、冻存和复苏的步骤都直接影响原代干细胞复苏后的细胞活力、增殖能力和分化潜能等。
 
原代培养实例1


图2. 人骨髓间充质干细胞(BMSCs)细胞形态图。A.原代分离过夜后第一天BMSCs细胞形态(100×);B.BMSCs培养5天之后细胞形态(100×);C. 90%融合长满下BMSCs细胞形态(200×);D.DMEM培养基加10%FBS条件下的BMSCs细胞形态(200×)。(Shima,2015)
 
原代培养实例2


图3. 人脐带血间充质干细胞(UCB MSCs)细胞形态图。去除单个核细胞后的细胞经过单克隆筛选培养后,维持30%~60%融合的细胞培养形态(100×,标尺100μm)。(Lee, 2004)

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