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细胞周期检测 PI
2016-03-24 17:05:05
实验方法原理
细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程,称为细胞周期,通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。PI法是较常见的一种周期检测方法。PI为插入性核酸荧光染料,能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合,其结合的量与DNA的含量成正比例关系,用流式细胞仪进行分析,就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态,从而计算出各个期的百分含量。PI染色后,假设G0/G1期细胞的荧光强度为1,那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2,正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。由此可以得到细胞各个时期的分布状态,计算出G0/G1%、S%、G2/M%,了解增殖能力,在肿瘤病理学研究中,通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。

实验步骤及注意事项:
1.细胞样品的准备:
a.单次流式细胞仪检测,1份样品细胞数量约106.
b.收集细胞培养液备用。用胰酶(无EDTA)消化细胞,至细胞可以被轻轻用吹打下来时,加入前面收集的细胞培养液,吹打下所有的贴壁细胞,并轻轻吹散细胞。
c.将细胞悬液收集到10ml的离心管内。800g左右离心5min,沉淀细胞。小心吸除上清,残留约50微升左右的培养液,以避免吸走细胞。
d.加入1ml冰浴预冷的PBS,重悬细胞, 800g×5min。为减少细胞损失可用1.5ml离心。
e.再次离心沉淀细胞,小心吸除上清,残留约20ul左右的PBS,以 避免吸走细胞。重复第5步操作,用预冷的PBS再次洗细胞,并离心收集细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞,避免细胞成团,用250ul预冷的PBS重悬细胞。
2. 细胞固定:
缓慢加入750ul冰浴预冷无水乙醇,轻轻吹打混匀,4℃固定2小时或-20℃固定1小时,封口膜封口(此步可停止,-20℃保存样品,1周内样品检测不受影响)。
3. 染色:
a.1000g左右离心3-5min,沉淀细胞。小心吸除上清,可以残留约50ul左右的70%乙醇,以避免吸走细胞。
b.加入约1ml冰浴预冷的PBS,洗涤细胞一次。再次离心沉淀细胞,小心吸除上清。
c.用200ul预冷的PBS重悬细
d.加入Rnase A溶液20ul,37℃水浴30min。
e.每管细胞样品中加入400ul碘化丙啶染色液,缓慢并充分混匀后4℃避光孵育30 min。染色完成后宜在24h内完成流式检测。
4.流式检测和分析:
用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光,同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。

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