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细胞转染技术
常规转染技术分为稳定转染(永久转染)和瞬时转染两类。稳定转染是指外源DNA 既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体存在。瞬时转染则指外源DNA/RNA 不整合到宿主染色体中,一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它调控元件的分析。
 
转染方法不同,对转染结果影响很大。常见的转染方法有:
 
1. 磷酸钙法:该方法利用磷酸钙DNA 复合物吸附细胞膜被细胞内吞原理得到瞬时或稳定转染结果,操作简便但重复性差,不可用于原代细胞的转染。
 
2. DEAE-右旋糖苷法:带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞,可用于瞬时转染,方法相对简便、结果可重复但对细胞有一定的毒副作用。
 
3. 电穿孔法:利用高脉冲电压破坏细胞膜电位,DNA通过膜上形成的小孔导入。稳定转染,瞬时转染均适用。适用性广,但细胞致死率高,DNA 和细胞用量大, 需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件。
 
4. 病毒介导法:通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中。适用于稳定转染,可用于难转染的细胞、原代细胞,体内细胞等。随着病毒技术的发展,该方法的使用面整在越来越广。
 
5. 阳离子脂质体法:带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞,从而形成稳定转染或瞬时性转。该方法适用性广,转染效率高,重复性好,但转染时需去除血清。转染效果随细胞类型变化大。
 
6. 显微注射法:用显微操作将DNA 直接注入靶细胞核,适用于稳定转染和瞬时转染,转染细胞数有限,多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞。
 
除上述传统方法外,近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术,以其适用宿主范围广,操作简便对细胞毒性小,转染效率高受到研究者们的青睐。其中树枝状聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)的转染性能最佳,但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性,且其合成工艺复杂。聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子,每相隔二个碳个原子,即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子,使得聚合物网络在任何pH 下都能充当有效的“质子海绵”(proton sponge)体。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞,其效果好于脂质聚酰胺,经进一步的改性后,其转染性能好于树枝状聚合物,而且它的细胞毒性低。大量实验证明,PEI 是非常有希望的基因治疗载体
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