人骨髓间充质干细胞成软骨分化试剂盒 - 干细胞诱导分化产品 - 麒盟干细胞中心
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名称:人骨髓间充质干细胞成软骨分化试剂盒
货号:CHEM-200003
品牌:麒盟生物
详情:
规格:200 ml
价格:3160
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产品名称:人骨髓间充质干细胞成软骨分化试剂盒
货号:CHEM-200003
批号:见包装
试剂清单:

序号 名称 数量 货号
A 人骨髓间充质干细胞成软骨分化基础培养基 2 CHEM-200003-A
B 双抗 2 CHEM-200003-B
C 抗坏血酸 2 CHEM-200003-C
D 丙酮酸钠 2 CHEM-200003-D
E 地塞米松 2 CHEM-200003-E
F 脯氨酸 2 CHEM-200003-F
G ITS+Premix 2 CHEM-200003-G
H TGF-β3 2 CHEM-200003-H
I 阿利新蓝染色液 1 CHEM-200003-I
 
存储与有效期:
A、G、I液于2-8℃避光保存,其余溶液于-20℃(或更低温度)避光保存。所有组分均需要避免反复冻融及复温,I液有效期为6个月,其他组分在所需要的温度下有效期为1年。预混液于2-8℃保存,有效期为1个月,完全培养基现配现用。
产品介绍
人骨髓间充质干细胞(hBMSC)具有多向分化的潜能,体外在一定条件下可以诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞。2006年国际细胞治疗协会(ISCT)确定此三项检测指标是MSC鉴定的必检项目,目前以MSC为基础的研究报道均会对该三个指标进行鉴定。
为方便科研用户鉴定hBMSC的分化能力,麒盟干细胞研究中心精心优化hBMSC成软骨诱导分化试剂盒,其中包括成软骨诱导培养体系和鉴定所需要的染色液,让用户可以稳定有效地鉴定hBMSC的分化潜能。该试剂盒提供的实验方法为常规鉴定方法,用于鉴定hBMSC是否具有成骨分化能力。除此以外,试剂盒的诱导培养基还可用于诱导分化过程中的其他检测,如mRNA检测、lncRNA检测、microRNA检测、蛋白表达检测、免疫组化检测等。但若用于免疫荧光检测需注意自发荧光或固定方法问题。
本产品仅适用于科研。
操作方法
实验准备
试剂配制:
预混液:室温融化B-F溶液各1支,将融化的B-F溶液与G溶液1支加入A液中,晃动培养基使其充分混匀,配制成软骨分化培养基预混液。
注意:溶液溶解后旋涡混匀、1000g短时离心以使溶液集中于管底。将管内溶液加入A液后,吸取A液洗涤溶液瓶两次,将洗涤液加入A液中。所有液体混合成预混液必须充分混匀,2-8℃保存。
TGF-β3分装:室温溶解H液,根据每次换液需要的试剂量分装成小份,-20℃或更低温度保存。
诱导完全培养基:按照当次所需要的诱导液总量取相应的预混液与离心管中,加入相应量的TGF-β3,充分混匀制成诱导完全培养基,此液现配现用。1 ml预混液需添加TGF-β3的量为10 μl。
注意:H液可以根据需要分装成不同小份,-20℃或更低温度保存,每次使用时按照当次使用的量配制诱导完全培养基,完全培养基必须现配现用。整个过程需无菌操作,适当以75%酒精擦拭表面。
²  自备试剂:
l  消化液(0.25%Trypsin-0.04%EDTA)
l  磷酸盐缓冲液(DPBS)
l  hBMSC完全培养基
l  4%中性多聚甲醛溶液
注意:若hBMSC完全培养基不含血清,则需要准备胰酶抑制剂。hBMSC消化极易过度,建议稀释消化液一倍,且严格控制消化时间。
操作步骤
1.      准备所需诱导分化的hBMSC,当细胞融合达85%左右时,用消化液消化细胞,细胞沉淀用成软骨诱导预混液重悬。
2.      150 g离心5 min,沉淀以预混液重悬,细胞密度约1×106cells/ml,再次离心,弃上清。
3.      沉淀以成软骨诱导完全培养基重新悬浮,调整细胞密度为5×105cells/ml。
4.      分别取500 μl细胞悬液接种于15 ml离心管中,150 g离心5 min。
注意:成软骨诱导时每管细胞的总数在5×104至3×105之间,细胞数过少形成的软骨团块可能较小,细胞数过多则倾向于分开成块。正常情况下可形成1 mm3的团块。
5.      旋松离心管盖,将离心管轻轻置于37℃、5% CO2培养箱中静置培养。
注意:24 h内避免摇动细胞沉淀,以确保形成个团块。离心管需使用聚丙烯材质无菌管。
6.      诱导培养24 h后,轻轻拨动离心管底,使细胞沉淀团块悬浮,重新放回培养箱继续培养。
注意:细胞团块重新悬浮的时间因细胞而定,基本在24-48h之间,以细胞团周围有聚拢现象时为准。
7.      每2天更换新鲜完全诱导培养基。换液时轻轻吸取旧培养基,每管加新鲜配制的成软骨分化完全培养基500 μl。
注意:换液时动作轻柔,以免吸出软骨团块;诱导液必须经过37℃复温,否则影响诱导效果。在诱导培养2-3周后会出现大量细胞外基质,富含软骨蛋白多糖和Ⅱ型胶原。
8.      诱导培养结束时,弃去培养上清,DPBS洗细胞两次,4%中性多聚甲醛溶液2 ml/管室温固定细胞1小时。
注意:培养结束时或中途可以选择其他检测方法,如基因表达检测等,若采用自己拟定的检测方法则后续方案需要自己拟定。
9.      弃去固定液,DPBS洗2次,脱水、石蜡包埋后切片。
注意:脱水包埋可以用擦镜纸包裹后使用自动脱水机脱水、包埋,也可以在原离心管中逐级更换脱水、透蜡的液体,手工包埋。过程中一定注意团块不要丢失。
10.  阿利新蓝染色:将切片进行脱腊和复水,阿利新蓝染液染色30 min,流水冲洗5 min,脱水、透明、中性树胶封片,显微镜下观察、拍照。
注意:染色和制片过程中避免干片,干片后会导致组织形态发生变化,影响观察、拍照效果。根据需要可以选择苏木素复染。
11.  结果判定:按照程序操作完毕,低倍镜下观察可见蓝色着色,该蓝色染色的为酸性粘多糖,说明实验所用的hBMSC具有成软骨能力。否则,所使用的hBMSC无成软骨能力。
结果展示

 


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名称 货号
人骨髓间充质干细胞成骨分化试剂盒 CHEM-200001
人骨髓间充质干细胞成脂分化试剂盒 CHEM-200002
 

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